Servizio SANGER Premium
analisi di sequenze di DNA
Campioni PREMIUM e piastre sono campioni singoli e piastre che vengono processati normalmente secondo le due fasi:
- reazione con kit Brilliant Dye terminator
- elettroforesi su sequenziatore automatico
E’ un servizio a 360 gradi in cui è possibile richiedere consulenza sui risultati e vi è la possibilità di ripetizione del campione qualora lo staff ritenga che il risultato possa migliorare.
Requisiti per tipo di servizio
Questa pagina ha la funzione di dare tutte le indicazioni necessarie alla preparazione corretta dei campioni, in caso di dubbi leggere anche la sezione INDICAZIONI GENERALI.
TIPO CAMPIONE: PCR, plasmide essiccato a max 65 gradi
QUALITA’ CAMPIONE: integro, non contaminato, OD 260/280 >1.8
SOLUZIONE CAMPIONE: H2O con successivo essiccamento
QUANTITA’ CAMPIONE: 2X (max 15 µl)
- PCR 100-800 bp: 1-2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR 800-1500 bp: 2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR >1500 bp: 3 ng ogni 100bp (1X)
- Plasmide fino a 3000 basi: 200 ng (1X)
- Plasmide da 3000 a 5000 basi: 200-250 ng (1X)
- Plasmide da 5000 a 10000 basi: 250-350 ng (1X)
- Plasmide da 10000 a 15000 basi: 350-450 ng (1X)
- Plasmide oltre 15000 basi: 500 ng (1X)
QUANTITA’ PRIMER: 2X (6,4 pmoli) nel tubo del campione
CONTENITORE: tubo da 0.2 ml, strip da 0.2 ml
TEMPI: 1-2gg lavorativi
TIPO CAMPIONE: PCR, plasmide essiccato a max 65 gradi
QUALITA’ CAMPIONE: integro, non contaminato, OD 260/280 >1.8
SOLUZIONE CAMPIONE: H2O con successivo essiccamento
QUANTITA’ CAMPIONE: 2X (max 15 µl)
- PCR 100-800 bp: 1-2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR 800-1500 bp: 2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR >1500 bp: 3 ng ogni 100bp (1X)
- Plasmide fino a 3000 basi: 200 ng (1X)
- Plasmide da 3000 a 5000 basi: 200-250 ng (1X)
- Plasmide da 5000 a 10000 basi: 250-350 ng (1X)
- Plasmide da 10000 a 15000 basi: 350-450 ng (1X)
- Plasmide oltre 15000 basi: 500 ng (1X)
CONTENITORE: tubo da 0.2 ml, strip da 0.2 ml
TEMPI: 1-2gg lavorativi*
(*dall’arrivo del primer di sintesi)
TIPO CAMPIONE: PCR essiccata a max 65 gradi
QUALITA’ CAMPIONE: integro, non contaminato, OD 260/280 >1.8
SOLUZIONE CAMPIONE: H2O con successivo essiccamento
QUANTITA’ CAMPIONE: 2X (max 15 µl)
- PCR 100-800 bp: 1-2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR 800-1500 bp: 2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR >1500 bp: 3 ng ogni 100bp (1X)
QUANTITA’ PRIMER: 4X (12,8 pmoli) in tubo a parte
CONTENITORE: tubo da 0.2 ml, strip da 0.2 ml
TEMPI: 1-2gg lavorativi
TIPO CAMPIONE: PCR essiccata a max 65 gradi
QUALITA’ CAMPIONE: integro, non contaminato, OD 260/280 >1.8
SOLUZIONE CAMPIONE: H2O con successivo essiccamento
QUANTITA’ CAMPIONE: 2X (max 15 µl)
- PCR 100-800 bp: 1-2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR 800-1500 bp: 2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR >1500 bp: 3 ng ogni 100bp (1X)
CONTENITORE: tubo da 0.2 ml, strip da 0.2 ml
TEMPI: 1-2gg lavorativi*
(*dall’arrivo del primer di sintesi)
TIPO CAMPIONE: PCR, plasmide essiccato a max 65 gradi
QUALITA’ CAMPIONE: integro, non contaminato, OD 260/280 >1.8
SOLUZIONE CAMPIONE: H2O con successivo essiccamento
QUANTITA’ CAMPIONE: 2X (max 15 µl)
- PCR 100-800 bp: 1-2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR 800-1500 bp: 2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR >1500 bp: 3 ng ogni 100bp (1X)
- Plasmide fino a 3000 basi: 200 ng (1X)
- Plasmide da 3000 a 5000 basi: 200-250 ng (1X)
- Plasmide da 5000 a 10000 basi: 250-350 ng (1X)
- Plasmide da 10000 a 15000 basi: 350-450 ng (1X)
- Plasmide oltre 15000 basi: 500 ng (1X)
QUANTITA’ PRIMER: 2X (6,4 pmoli) nel tubo del campione
CONTENITORE: piastra da 96 pozzetti da 0.2 ml (NB: il pozzetto H12 va lasciato vuoto)
TEMPI: 1-2gg lavorativi
TIPO CAMPIONE: PCR, plasmide essiccato a max 65 gradi
QUALITA’ CAMPIONE: integro, non contaminato, OD 260/280 >1.8
SOLUZIONE CAMPIONE: H2O con successivo essiccamento
QUANTITA’ CAMPIONE: 2X (max 15 µl)
- PCR 100-800 bp: 1-2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR 800-1500 bp: 2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR >1500 bp: 3 ng ogni 100bp (1X)
- Plasmide fino a 3000 basi: 200 ng (1X)
- Plasmide da 3000 a 5000 basi: 200-250 ng (1X)
- Plasmide da 5000 a 10000 basi: 250-350 ng (1X)
- Plasmide da 10000 a 15000 basi: 350-450 ng (1X)
- Plasmide oltre 15000 basi: 500 ng (1X)
CONTENITORE: piastra da 96 pozzetti da 0.2 ml (NB: il pozzetto H12 va lasciato vuoto)
TEMPI: 1-2gg lavorativi*
(*dall’arrivo del primer di sintesi)
TIPO CAMPIONE: PCR essiccata a max 65 gradi
QUALITA’ CAMPIONE: integro, non contaminato, OD 260/280 >1.8
SOLUZIONE CAMPIONE: H2O con successivo essiccamento
QUANTITA’ CAMPIONE: 2X (max 15 µl)
- PCR 100-800 bp: 1-2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR 800-1500 bp: 2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR >1500 bp: 3 ng ogni 100bp (1X)
QUANTITA’ PRIMER:
- primer uguale per tutta la piastra: 1600 pmoli secchi (16 ul di un primer concentrato 100uM) in tubo da 1.5 ml
- primer diversi: 4X (12,8 pmoli) in piastra da 96 pozzetti a parte, mantenendo in piastra la posizione campione-primer
CONTENITORE: piastra da 96 pozzetti da 0.2 ml con relativi tappi in strip (NB: il pozzetto H12 va lasciato vuoto)
TEMPI: 1-2gg lavorativi
TIPO CAMPIONE: PCR essiccata a max 65 gradi
QUALITA’ CAMPIONE: integro, non contaminato, OD 260/280 >1.8
SOLUZIONE CAMPIONE: H2O con successivo essiccamento
QUANTITA’ CAMPIONE: 2X (max 15 µl)
- PCR 100-800 bp: 1-2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR 800-1500 bp: 2 ng ogni 100bp (1X)
- PCR >1500 bp: 3 ng ogni 100bp (1X)
PRIMER: il primer dovrà essere lo stesso per tutta la piastra
CONTENITORE: piastra da 96 pozzetti da 0.2 ml con relativi tappi in strip (NB: il pozzetto H12 va lasciato vuoto)
Tempi: 1-2gg lavorativi*
*dall’arrivo del primer di sintesi
INDICAZIONI GENERALI
- Se possibile usare le strip di tubini
- Non mettere parafilm sui singoli tubini
- Non usare lo scotch per raggruppare i tubini
- Proteggere adeguatamente i tubini durante la spedizione
- Scrivere chiaramente il codice sui tubini, in particolare 5 e S, O e Ø (zero)
- Se si appongono etichette sui tubini, usare il minimo indispensabile di nastro adesivo
- Campioni risultanti non conformi ai requisiti possono subire dei ritardi o non venire processati; in ogni caso non verranno ripetuti in caso di problemi.
Allestimento campioni:
- DNA e primer devono essere già mescolati nello stesso tubino da 0,2 ml
- assicurarsi che il volume sia sul fondo
- lasciare evaporare ponendo il tubino sul termociclatore a max. 65°C con tappo aperto
NB:
- Non liofilizzare perchè si rischia che il pellet si stacchi dal fondo.
- Non lasciare seccare più del necessario (campioni seccati eccessivamente possono avere problemi nella risospensione e portare a risultati non soddisfacenti).
- Non seccare più di 15 ul; se si eccedono i 15 ul, precipitare il DNA ed inviare il pellet secco dopo un lavaggio con etanolo 70%, per evitare un eccesso di sali.
Requisiti campioni:
In generale il DNA deve essere:
- PULITO: privo di sali, proteine, fenolo, resine, altri acidi nucleici (nucleotidi, primer ed RNA). La maggior parte dei fallimenti di sequenze è imputabile alla qualità del DNA; il sequenziamento con tecnologia capillare richiede un campione molto pulito; seguire attentamente le istruzioni, sulla preparazione del DNA, presenti nei kit commerciali che scegliete di utilizzare; per la risospensione o diluizione del templato e dei primer utilizzare rigorosamente acqua deionizzata, mai TE.
- UNICO: DNA derivante da un solo clone batterico o fagico. Una sola banda se si tratta di prodotto di PCR.
- CORRETTAMENTE QUANTIZZATO:
- Misurazione allo spettrofotometro dell’assorbanza a 260 nm (rapporto 260/280 e 260/230) che permette di vedere contaminazioni di proteine, sostanze organiche (fenolo), ma non la presenza di RNA o altri DNA contaminanti (spesso sovrastima la reale quantità del DNA da sequenziare).
- Corsa su gel di agarosio, associata ad un marcatore di peso molecolare, che permette di vedere RNA e DNA contaminanti ma non proteine (consigliata)
- Fluorimetro che è lo strumento più affidabile.
NB: Nessuno di questi metodi permette di rilevare la presenza di sali.
Si consiglia di combinare più di un metodo per avere un’idea più precisa della qualità.
Istruzioni quantificazione: http://www.bmr-genomics.it/file/quantificazione_gel.pdf
FORMULE DETERMINAZIONE DEL PESO MOLECOLARE
PM = [(Ax312.2) + (Gx328.2) + (Cx288.2) + (Tx303.2) – 61.0]
A=n° di A, G=n° di G, C=n° di C, T=n° di T in un oligo
FATTORE DI CONVERSIONE
1 OD260 unit = 33ug of DNA (Single Stranded DNA)
1 OD260 unit = 50ug of DNA (Double Stranded DNA)
nmol di oligo = (OD260 unità x 90) / (La lunghezza dell’oligo)
Quantità consigliate (1X)
- Prodotti di PCR: 1-2 ng ogni 100 basi
- DNA ds: plasmide + inserto:
- fino a 3000 basi 200 ng
- da 3000 a 5000 basi 200-250 ng
- da 5000 a 10000 basi 250-350 ng
- da 10000 a 15000 basi 350-450 ng
- oltre 15000 basi 500 ng
- DNA ss: 50-100 ng
- Cosmidi, BAC, PAC e fagi con inserti grandi: 0,75-1,0 ug
Purificazione PCR quando la banda è singola
EXOSAP (reazione enzimatica): esonucleasi I e fosfatasi alcalina (Shrimp Alkalin Phosphatase). Gli enzimi degradano rispettivamente primer e dNTPs, ma non rimuovono sali o altri prodotti secondari della PCR
Questo è il metodo utilizzato anche dal nostro servizio sequenziamento.
Pro:
- semplice
- veloce
- economico
- non si deve riquantificare il DNA perché non c’è perdita alcuna di DNA
Contro:
- i prodotti secondari della PCR non vengono eliminati (sali) e possono interferire con il sequenziamento
- alcune taq possono lasciare residui che interferiscono con il sequenziamento
- gli enzimi sono estremamente sensibili al calore e si degradano facilmente
- un eccesso di primer residui (forte nuvola di primer nel gel di agarosio) può saturare la capacità di lavoro degli enzimi
ATTENZIONE:
– quando i campioni vengono seccati può rimanere un minimo residuo di glicerolo che non evapora. Eventualmente seccare in parallelo un volume equivalente di acqua per evitare di seccare eccessivamente i campioni. L’eventuale residuo non dà problemi nel sequenziamento, purchè in minime quantità.
- La Red Taq o la GoTaq green promega (in genere mix di PCR molto ricche in enhancer) sembrano dare problemi se associate a questo metodo di purificazione (funzionano bene con il metodo del binding a colonnina o biglie)
- Un eccesso di primer residui nella PCR (visibile come nuvola di basso peso molecolare in gel di agarosio) può risultare in una sequenza doppia se viene saturata la capacità di lavoro degli enzimi.
COLONNINE COMMERCIALI: primer e dNTPs e reagenti di PCR vengono eliminati tramite lavaggi del DNA che rimane attaccato alla membrana
Pro:
- Elimina tutti i prodotti secondari di PCR: primer, dNTPs ma anche sali. Può sostituire gli enzimi qualora con questi ci fossero problemi.
Contro:
- più lento e laborioso degli enzimi.
- economicamente più costoso
- il DNA va riquantificato perché c’è perdita di materiale
ATTENZIONE:
La purificazione tramite legame del DNA a colonnine può dare problemi quando l’agente caotropico (sale) non viene completamente eliminato; nel caso di problemi si consiglia di:
- aumentare il numero di lavaggi con la soluzione contenente etanolo
- aumentare il tempo della spinnata a vuoto prima dell’eluizione del DNA dalla colonnina.
- precipitare il DNA una volta eluito può dare lo stesso tipo di problemi di sali
Purificazione PCR: da gel quando le bande sono multiple
SCONSIGLIATO, SE NON IN CASI DI STRETTA NECESSITA’
Estrazione da gel utilizzando colonnine commerciali
Le sequenze fatte a partire da DNA estratto da gel sono spesso corte e con segnale basso; per la riuscita del metodo si consiglia di:
- utilizzare agarosio ultra puro
- ridurre al minimo le dimensioni della banda tagliata
- aumentare il numero di lavaggi con la soluzione contenente etanolo
- aumentare il tempo della spinnata a vuoto prima dell’eluizione del DNA dalla colonnina.
Sono particolarmente sconsigliati i kit con resine in sospensione in quanto facilmente rimangono residui nel campione che disturbano la reazione di sequenziamento.
Purificazione PCR: nessuna purificazione
SCONSIGLIATO, SE NON IN CASI DI STRETTA NECESSITA’
In caso di grossi progetti di sequenziamento, è possibile non purificare i prodotti di PCR rispettando i seguenti requisiti:
- la lunghezza inferiore alle 500 basi
- la PCR è stata fatta in condizioni che minimizzano i residui di primer e dNTPs residui
PROTOCOLLO PER PCR di max 500 basi – concentrazioni finali:
- dNTPS 125 uM
- primer 0.07 uM ciascuno
- Taq 0.01 U
In queste condizioni la non-purificazione influisce negativamente sulla risoluzione dei picchi a partire da 450 basi circa.
Il protocollo comunque deve essere testato per verificare che si adatti al proprio templato.
Si consiglia di contattare il Sequencing Core per eventuali suggerimenti.
Purificazione PLASMIDI, FAGI, BAC, PAC, COSMIDI
Sono disponibili molti kit commerciali per MiniPrep, ma consigliamo di assicurarsi sempre presso il rivenditore che il kit sia adatto per sequenziamento (non tutti funzionano bene!).
FAGI M13:
- Kit commerciali (Controllare dal fornitore che siano adatti)
- TermoMAX *
PLASMIDI:
- Kit commerciali (Controllare dal fornitore che siano adatti)
- Lisi Alcalina più Precipitazione con PEG *
- Bandeggio con Cesio cloruro (CsCl) *
BAC, PAC, cosmidi:
- Kit commerciali (Controllare dal fornitore che siano adatti)
- Lisi Alcalina con doppia estrazione con fenolo e precipitazione con isopropanolo *
- Bandeggio con Cesio cloruro (CsCl) *
*(consigliato sulla guida Applied Biosystems, mai testato da noi)
La qualità del DNA plasmidico preparato da batteri può essere diversa a seconda dei ceppi che si utilizzano come ospite.
Raccomandati: DH5 alpha, HB101, XL-1 Blue, JM109, MV1190
Non raccomandati: JM101
PRIMER UTENTE
NELLA PRENOTAZIONE:
selezionare “NO” nella fase di descrizione del campione nella colonna primer
PRIMER UTENTE INVIATI A PARTE (solo nei casi per cui è previsto es.Exosap)
Inviare eventuali primer per il sequenziamento in tubi da 0.2 ml separati, secchi, in quantità 4X per ciascun campione a cui va aggiunto.
Sul tubino del primer riportare il codice del campione e una P che lo distingua dal DNA
NELLA PRENOTAZIONE:
selezionare “NO” nella fase di descrizione del campione nella colonna primer
PRIMER UNIVERSALI
Il servizio fornisce gratuitamente alcuni primer universali (vedi sotto)
NELLA PRENOTAZIONE:
selezionare il primer richiesto nella fase di descrizione del campione.
SINTESI, PROGETTAZIONE E MARCATURA
E’ possibile richiedere le sintesi di primer da usare per il sequenziamento o per genescan, con le opzioni di progettazione e marcatura.
NELLA PRENOTAZIONE:
selezionare il link “sequenziamento standard e primer”.
NB: Per la PROGETTAZIONE inviare la sequenza testo 5′->3′ con almeno 200 basi a monte del tratto da sequenziare, considerando che la reazione di sequenziamento allungherà il 3′ e che le prime 30 basi potrebbero non essere leggibili per problemi tecnici di risoluzione.
ATTENZIONE:
I primer vengono sintetizzati da una ditta esterna che impiega 2-3 giorni lavorativi per la consegna; la data di arrivo dei primer è visibile alla pagina Resosconto – Elenco primer.
Primer prenotati entro le 10,50 vengono ordinati alla ditta lo giorno stesso; quelli prenotati dopo le 10,50 vengono ordinati alla ditta il giorno successivo.
Non è possibile annullare ordini già inviati alla ditta produttrice.
E’ responsabilità dell’utente controllare che il primer richiesto rispetti le caratteristiche base per il sequenziamento.
I primer così ordinati vengono utilizzati nel laboratorio di BMR Genomics (non vengono spediti all’utente); possono essere utilizzati anche in prenotazioni successive, indicando nella prenotazione il codice relativo.
Sono tenuti e resi disponibili all’utente per 3 anni dalla data di arrivo o fino ad esaurimento (se prima dei 3 anni).
Quantità di primer da inviare:
Tipo di campione | 1X | 2X | 4X |
PCR, DNA ss e ds | 3,2 pmoli | 6,4 pmoli | 12,8 pmoli |
Cosmidi, BAC, PAC e fagi con inserti grandi | 30 pmoli | 60 pmoli | 120 pmoli |
Caratteristiche primer di sequenziamento:
- Per il servizio di sequenziamento Sanger NON UTILIZZARE primer con modificazioni o coniugati a fluoroforo.
- I primer devono essere almeno 18-20 nucleotidi di lunghezza (max 25)
- Primer con lunghi tratti formati da una singola base dovrebbero essere evitati, particolarmente importante evitare 3 o più G o C di seguito
- I Primer devono avere temperatura di melting intorno ai 50°C
- I primer devono avere un contenuto di G/C tra 40% e 60%
- I primer non devono contenere regioni complementari al loro interno; cioè non devono poter formare forcine. In caso contrario il primer si ripiegherebbe su se stesso risultando poco efficace come innesco della reazione di sequenziamento e quindi provocando un calo generale del segnale
- Evitare i primer che formano dimeri tra se stessi o eventualmente con i primer di PCR .
- Scartare i primer che abbiano più di 4 legami tra loro consecutivi o 8 in totale; scartare in particolare quelli che formano dimeri tra le regioni 3′
- Se possibile, lanciare una ricerca di similarità del primer contro il vettore e la sequenza del DNA inserto (se già si conosce) per verificare che la sequenza del primer, ma specialmente le 8-10 basi in 3′, sia unica
- Non costruire primer degenerati. Non richiedere Inosina nei primer di sequenziamento. Entrambi non funzionano o producono scarsi risultati nel cycle sequencing
- I primer vanno risospesi in ddH2O
- La regione di sequenza su cui si costruisce il primer deve essere affidabile e si deve tenere conto che normalmente le prime 20 basi dopo il primer non sono correttamente leggibili
- Per una reazione di sequenziamento di PCR DNA ds e ss sono necessarie 3,2 pmoli di primer, per BAC PAC e cosmidi 30 pmoli
- E’ possibile richiedere le sintesi di primer da usare per il sequenziamento. L’operazione viene effettuata tramite l’apposita tabella alla pagina prenotazione, dove è possibile trovare anche maggiori dettagli
- Nella costruzione dei primer di sequenziamento considerare il fatto che in genere le prime 20-25 basi non sono risolte correttamente.
DETERMINAZIONE DEL PESO MOLECOLARE ESATTO DI UN OLIGO
PM = [(Ax312.2) + (Gx328.2) + (Cx288.2) + (Tx303.2) – 61.0]
A=n° di A, G=n° di G, C=n° di C, T=n° di T in un oligo
FATTORE DI CONVERSIONE DEGLI OLIGO
1 unità OD260 = 30µg di un oligo
nmol di oligo = (OD260 unità x 90) / (La lunghezza dell’oligo)
VERIFICA PRIMER DI SEQUENZIAMENTO modulino
Inserisci la sequenza nel box per una verifica del primer di sequenziamento
Attenzione! I risultati sono solo indicativi.
Questo software infatti è sperimentale perchè appositamente tarato dal suo sviluppatore per primer di sequenziamento, è importante visualizzare le info risultanti per valutare l’effettiva bontà del primer.
Contribuisci a migliorarlo, segnalando incoerenze e anomalie al nostro staff.
PROGRAMMI PER LA COSTRUZIONE DI OLIGONUCLEOTIDI
Clicca qui
Primer universali
PRIMER UNIVERSALI DISPONIBILI GRATUITAMENTE
- M13 For-> TTGTAAAACGACGGCCAGT
- M13 Rev-> CAGGAAACAGCTATGACC
- T3-> AATTAACCCTCACTAAAGGGA
- T7-> TAATACGACTCACTATAGGG
- T7 term -> GCTAGTTATTGCTCAGCGG
- SP6-> GATTTAGGTGACACTATAG
- OligodT-V-> TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV
- pc2R-> CTCGGATCCACTAGTAACG
- BGH Rev -> TAGAAGGCACAGTCGAGG
- CMV For-> CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG
- PGEX3 -> CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG
- PGEX5 -> GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG
- Polyhedrin For -> AAATGATAACCATCTCGC
- Polyhedrin Rev -> GTCCAAGTTTCCCTG
- PBAD For -> ATGCCATAGCATTTTTATCC
- PBAD Rev -> GATTTAATCTGTATCAGG
- EGFP-N -> CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG
- EGFP-C -> GTCCTGCTGGAGTTCGTG
- RVprimer3 -> CTAGCAAAATAGGCTGTCCC
- RVprimer4 -> GACGATAGTCATGCCCCGCG
- GLprimer1 -> TGTATCTTATGGTACTGTAACTG
- GLprimer2 -> CTTTATGTTTTTGGCGTCTTCC
- AOX1 For -> GACTGGTTCCAATTGACAAGC
- AOX1 Rev -> GCAAATGGCATTCTGACATCC
ATTENZIONE: Controllare sempre che la sequenza del primer che richiedete corrisponda a quella che si appaia con il vostro templato.
Solo corsa elettroforetica
Chi usufruisce del servizio di solo corsa deve utilizzare kit Applied Biosystems con la chimica Big Dye versione 1 o 3, oppure kit Nimagen chima brilliant dye o bright dye. Per un buon risultato della reazione, si consiglia comunque di seguire le linee guida descritte nel sito.
Inviare il DNA come pellet.
Nel caso in cui i campioni finali siano liquidi (purificazione con colonnine) precipitare o lasciare seccare a temperatura ambiente, non seccare a 65°.
E’ possibile inviare liquido previo accordo con lo staff.
NELLA PRENOTAZIONE:
Specificare il tipo di chimica utilizzata.
Piastre da 96
Le piastre da 96 pozzetti possono contenere massimo 95 campioni; H12 deve rimanere libero per il pGem di controllo.
Ai campioni della piastra si applicano gli stessi requisiti descritti sopra per campioni singoli. Le piastre devono avere pozzetti a V (piastre da PCR).
Si prega di segnalare eventuali pozzetti vuoti.
E’ possibile applicare un proprio sample sheet; i file di sequenza avranno così come descrizione i nomi da voi specificati, piuttosto che le coordinate della piastra attribuite dal software di prenotazione.
Nel caso in cui sia richiesta la purificazione vedere sezione purificazione.
Primer universali e/o dmso, se richiesti, saranno aggiunti a tutti i pozzetti.
L’opzione “piastra <450 basi” garantisce la lettura fino a 450 basi; se interessa la lettura delle prime 450 basi ma il templato è più lungo di 450, l’opzione è consigliata per templati di PCR fino a 1000 basi; è sconsigliata se il templato è costituito da plasmidi (le sequenze potrebbero morire presto).
Non si effettuano operazioni diverse sui singoli campioni.
Sequenziamento BAC, PAC, COSMIDI e FAGI
Nel caso di templati grandi è necessario effettuare la reazione con il doppio di reagenti e un ciclo di sequenziamento più lungo.
NELLA PRENOTAZIONE: Selezionare la pagina SEQUENZIAMENTO BAC PAC COSMIDI FAGI (opzione dGTP) al momento di descrivere il campione nel menu templato selezionare il templato corrispondente.
Prep di plasmidi e BAC
Inviare i batteri strisciati su piastra petri in modo da poter individuare colonie singole.
Inviare eventuali primer per il sequenziamento in tubi da 0,2 ml separati, secchi, in quantità 4X per ciascun campione a cui va aggiunto. Sul tubino del primer riportare il codice del campione e una P.
Contattare il servizio per un preventivo
Purificazione di PCR
Inviare il prodotto di PCR (max 10 ul) secco in tubini da 0,2 ml, nelle corrette quantità 2X.
Inviare eventuali primer per il sequenziamento in tubi da 0.2 ml separati, secchi, in quantità 4X per ciascun campione a cui va aggiunto.
Sul tubino del primer riportare il codice del campione e una P che lo distingua dal DNA
Nel caso in cui sia richiesta la purificazione e sia quindi necessario aggiungere il/i primer:
- se il primer è lo stesso per tutta la piastra, inviare un unico tubo contenente 1600 pmoli secchi (16 ul di un primer concentrato 100uM); in questo caso è possibile richiedere eventualmente un primer di sintesi.
- se il primer non è lo stesso per tutti i campioni inviare una piastra contenente i primer in quantità 4X disposti negli stessi pozzetti dei campioni a cui andranno aggiunti; in questo caso non è possibile richiedere primer di sintesi.
NELLA PRENOTAZIONE : Selezionare “EXOSAP” nel menu “extra”.
PCR
Inviare il DNA stampo in forma liquida, alla concentrazione di 10ng/ul, assieme al ciclo e alle condizioni di amplificazione.
All’arrivo del templato verrà inviata una email di notifica, ma le sequenze risulteranno arrivate (pagine risultati) solo quando la PCR avrà dato esito positivo.
Le PCR viene effettuata solo su templati che dovranno poi essere sequenziati.
Per ogni PCR deve essere inviato un tubino di templato, denominato con il codice del primo campione da sequenziare riferito alla PCR.
NELLA PRENOTAZIONE:
Utilizzare il form di prenotazione delle sequenze standard; al momento della descrizione dei campioni selezionare l’apposita opzione nel menu “extra”: PCR CON PURIFICAZIONE.
Indicare nelle note ciclo e condizioni di PCR e le dimensioni attese della banda.
NOTA:
Verrà fatto un eventuale secondo tentativo di amplificazione nelle stesse condizioni fornite dall’utente, solo qualora lo staff ritenga che possa esserci stato un problema di processo; nel prezzo è compresa l’amplificazione di un eventuale controllo positivo (se possibile) e negativo.
I tempi di esecuzione della PCR sono di 3-5 giorni in funzione di eventuali code di processo, a cui poi vanno aggiunti i tempi di esecuzione di eventuale sequenziamento.
In caso di risultato positivo di PCR verranno processate tutte le sequenze prenotate relative alla PCR.
La prenotazione del servizio viene fatta esclusivamente via web alla pagina PRENOTAZIONE
Inviare campione (secco) in tubini, strip o piastre a temperatura ambiente.
E’ possibile inviare il campione con il nostro corriere convenzionato, selezionando l’opzione specifica al momento della prenotazione.
Per i dettagli alla pagina SPEDIZIONE.
1-2 giorni per campioni STD (reazione più corsa)
Per permettere all’utente di gestirsi meglio nella consegna dei campioni, riportiamo sotto una tabella indicativa e non vincolante per il servizio dei tempi di consegna dei risultati in funzione dell’arrivo dei campioni in laboratorio.
consegna dei risultati -> arrivo dei campioni
risultati la mattina successiva -> campioni singoli entro le 10:30
risultati il pomeriggio successivo -> campioni singoli entro le 16:30
risultati il giorno successivo -> piastre entro le 16:30
Ad esempio, campioni consegnati prima delle 16:30 possono entrare nelle piastre che vengono processate over-night (qualora ce ne siano) mentre quelli consegnati oltre le 16:30 del pomeriggio è come se fossero consegnati la mattina successiva.
Per ogni campione sarà reso disponibile cromatogramma in formato .ab1 visualizzabile online oppure scaricabile dal sito.
Le cause di fallimento possono essere diverse:
- la presenza di sostanze che inibiscono la reazione di sequenziamento (sali, proteine ecc …)
- DNA degradato
- quantità non corrette
- primer non corretti
- fattori intrinseci al DNA
Per fattori di disturbo intrinseci al DNA si intende la presenza di regioni che rendono difficile il lavoro della polimerasi provocando errori nella reazione di sequenziamento.
Questi problemi, che sono spesso causa di fallimento della sequenza, non sono prevedibili. L’unica soluzione è ripetere la sequenza utilizzando strategie particolari quali variazioni nel ciclo standard di sequenziamento, aggiunta di DMSO, utilizzo di kit speciali di sequenziamento:
- Alto contenuto in G/C: Templati con un contenuto >60% possono essere difficili e si manifestano con un segnale debole e un alto rumore di fondo. Anche templati con una percentuale equilibrata di GC possono avere delle regioni ricche in G/C che danno problemi.
Se si tratta di poche ambiguità questo può essere risolto sequenziando l’altro filamento. - Sequenze ricche di AT: sono meno problematiche
- Strutture secondarie: si manifestano con un’improvvisa perdita di segnale dovuta al fatto che l’enzima non riesce a procedere oltre
- Repeat:
- Di-, tri- e tetra-nucleotide normalmente non presentano difficoltà in materiale clonato, mentre in prodotti di PCR danno problemi di slittamento già a monte del sequenziamento che diventa molto difficile da fare (Ref: Odelberg et al, Nucleic Acids Research.1995, Vol. 23, No.11, 2049-2057).
- Repeat più lunghe, quali “Variable tandem repeat” di 30 o più basi ripetute molte volte sono molto difficili da sequenziare.
- Repeat AG possono essere problematiche perchè la Taq FS produce picchi deboli dopo una A
- Regioni omopolimeriche: danno problemi quando si superano le 10 basi uguali consecutive, ma anche meno nel caso di G e C, a causa di slittamenti dell’enzima.
Pagina Troubleshooting http://www.bmr-genomics.it/bmr_it/troubleshooting.html
https://www.nimagen.com/media/155398/nima_18-03_brilliant-dye-a4.pdf