Sequenziamento Sanger
Identificazione fungina (ITS)

• Se possibile usare le strip di tubini
• Non mettere parafilm sui singoli tubini
• Non usare lo scotch per raggruppare i tubini
• Proteggere adeguatamente i tubini durante la spedizione
• Scrivere chiaramente il codice sui tubini, in particolare 5 e S, O e Ø (zero)
• Se si appongono etichette sui tubini, usare il minimo indispensabile di nastro adesivo
• Campioni risultanti non conformi ai requisiti possono subire dei ritardi o non venire processati; in ogni caso non verranno ripetuti in caso di problemi.

Per ogni fungo da tipizzare, inviare 200 ng (conc. 20 ng/ul) di DNA genomico estratto.

Nel caso sia richiesta l’estrazione, inviare in tubini da 0,2 ml una colonia microlisata (5 min. a 100 °C) in 50 ul di un buffer qualsiasi 1X di PCR o in acqua.

E’ possibile inviare anche un frammento di tessuto 300-500 mg.

All’atto della prenotazione, indicare il nome del campione, le sequenze che verranno generate successivamente (in numero variabile a seconda del tipo di servizio che si sceglie), verranno automaticamente nominate utilizzando come prefisso il nome del campione.

Siglare il tubo con il codice numerico che viene generato al momento della prenotazione.

All’arrivo del materiale in laboratorio viene inviata un’email di notifica di arrivo materiale.

Alla pagina “risultati” i campioni non saranno presenti fino a che non si otterrà l’amplificato del gene; solo allora i campioni compariranno nel sito web.

Il servizio IDENTIFUNGO consiste di tre fasi:

• amplificazione del gene di interesse
• sequenziamento
• ricerca di omologia in database.

Garantiamo due tentativi di amplificazione in cui viene effettuato, oltre al controllo negativo, anche un controllo positivo a partire da un DNA genomico noto.

Nel caso delle regioni ITS il sequenziamento restituisce circa 700 basi (2 sequenze) che coprono le regioni ITS1 e ITS2. Questa regione è la maggiormente utilizzata per l’identificazione di specie fungine ed è in genere sufficiente per l’identificazione a livello di specie.

Nel caso delle regioni D1 e D2 (LSU) il sequenziamento restituisce circa 700 basi (2 sequenze).

Questa regione è molto utilizzata in particolare per l’identificazione di specie di lieviti.

Nel caso delle regioni ITS1, ITS2, D1 e D2 il sequenziamento restituisce circa 1500 basi (4 sequenze) che in genere sono sufficienti per l’identificazione a livello di specie.

L’utente riceverà come risultati:

• le singole sequenze (file cromatogrammi) scaricabili alla pagina risultati
• report con i risultati della ricerca di omologia (blast) e con la sequenza consenso in formato testo (consenso)

Sarà eventualmente disponibile, su richiesta, la foto del gel con i risultati della PCR.

Il tempo minimo per l’analisi è di 3 giorni lavorativi dall’arrivo dei campioni. In genere, dalla produzione delle sequenze all’invio dei risultati finali è necessario un giorno.

Nel caso di problemi nell’amplificazione (la coppia standard di primer non funziona), o di sequenziamento, i TEMPI possono allungarsi.

I campioni possono essere spediti a temperatura ambiente ma per evitare rischi di degradazione sarebbe preferibile che i campioni fossero spediti a 4 gradi.

E’ responsabilità dell’utente proteggere adeguatamente i campioni da eventuali schiacciamenti.

Le cause di fallimento possono essere diverse:

• la presenza nel microlisato di sostanze che inibiscono la reazione di PCR
• la presenza di funghi non appartenenti alla stessa colonia
• i primer universali non trovano un sito di attacco adeguato (primer specifici per la specie in oggetto ovviamente funzionerebbero)
• presenza di polimorfismi di lunghezza che possono rendere le sequenze illeggibili da quel punto in avanti.

I costi del servizio sono consultabili alla pagina listino prezzi.

Nei casi in cui non si proceda oltre la fase di amplificazione, verrà addebitato solo il costo delle attività svolte, pari a 20 Euro a campione, se era richiesta anche l’estrazione verranno addebitati 30 Euro a campione.

• Seifert KA (2009) Progress toward DNA barcoding of fungi, Molecular Ecology Resources 9 (Suppl.1), pp 83-89.