Elettroforesi di frammenti di DNA
BMR Genomics mette a disposizione dei propri utenti il servizio di genotyping per l’analisi di microsatelliti e frammenti, sfruttando i sequenziatori automatici Applied Biosystems.
Il servizio base consiste nel caricamento su sequenziatore capillare ABI di frammenti marcati con appositi fluorofori. L’elettroforesi capillare consente la separazione dei frammenti in base alle dimensioni e il software di analisi assegna le dimensioni ai picchi individuati e genera un file (cromatogramma) con la caratteristica estensione .fsa.
Carichiamo sia frammenti prodotti custom dall’utente, sia frammenti generati tramite kit di vario genere ad esempio kit per identificazione personale, analisi di parentela, identificazione di altri organismi, kit per ALFP, MPLA, con svariati filtri e size standard presenti in commercio.
NOTA:
Per campioni prodotti con kit commerciali che prevedono l’uso di size standard inclusi nel kit, sarà richiesto anche l’invio del size standard nella quantità necessaria per processare i campioni della prenotazione.
Tramite il servizio CUSTOM PRIMER è possibile ordinare primer marcati per i propri esperimenti.
Progetti speciali
Su richiesta mettiamo a punto nuovi protocolli di amplificazione. Multiplexiamo sia in fase di caricamento che di PCR per consentire all’utente di risparmiare. Grazie ai nostri sistemi informatici e di automazione siamo in grado di gestire progetti con un numero medio e grande di campioni, a partire dall’estrazione o dall’amplificazione, in totale tracciabilità e sicurezza.
Accedi alla pagina di richiesta preventivo per sottoporci le tue necessità.
Requisiti per tipo di servizio
Questa pagina ha la funzione di dare tutte le indicazioni necessarie alla preparazione corretta dei campioni, per dubbi leggere anche la sezione INDICAZIONI GENERALI.
TIPO DI CAMPIONE: PCR marcata
CHIMICA: marcatura compatibile
SOLUZIONE CAMPIONE: secco/buffer PCR
QUANTITA’ CAMPIONE: 2X
CONTENITORE: tubo da 0.2 ml, strip da 0.2 ml
TEMPI: fino a un massimo di 3 gg lavorativi
TIPO DI CAMPIONE: PCR marcata
CHIMICA: marcatura compatibile
SOLUZIONE CAMPIONE: secco/buffer PCR
QUANTITA’ CAMPIONE: 2X
CONTENITORE: tubo da 0.2 ml, strip da 0.2 ml
TEMPI: 1-2gg lavorativi
TIPO DI CAMPIONE: PCR marcata
CHIMICA: marcatura compatibile
SOLUZIONE CAMPIONE: secco/buffer PCR
QUANTITA’ CAMPIONE: 2X
CONTENITORE: piastra da 96 pozzetti da 0.2 ml
TEMPI: 1-2gg lavorativi
INDICAZIONI GENERALI
- Se possibile usare le strip di tubini
- Non mettere parafilm sui singoli tubini
- Non usare nastro adesivo per raggruppare i tubini
- Proteggere adeguatamente i tubini durante la spedizione
- Scrivere chiaramente il codice sui tubini, in particolare 5 e S, O e Ø (zero)
- Se si appongono etichette sui tubini, usare il minimo indispensabile di nastro adesivo
- Campioni risultanti non conformi ai requisiti possono subire dei ritardi o non venire processati; in ogni caso non verranno ripetuti in caso di problemi.
Per il servizio di corsa elettroforetica di Genescan:
- inviare 10 ng di PCR per ciascun marcatore (già mescolati se facenti parte dello stesso campione da caricare); nel caso non si conosca la quantità in ng, ma si abbia un riferimento di volume, inviare la quantità 2X, cioè il doppio della quantità che si desidera venga caricata (esempio 1: se il manuale del kit indica di caricare 1 ul, inviare 2 ul; esempio 2: se si è verificato che un certo volume di campione produce un segnale d’intensità ottimale, inviare il doppio del volume verificato).
- seccare il campione a 65°C max
- se il campione viene inviato liquido, portare a 5 µl totali con acqua e indicarlo nelle note
- utilizzare solo tubi da 0,2 ul.
OPZIONE 16 CAMPIONI
- fornire due strip da 8 tubini
- il nome dei campioni sarà: ‘nome del gruppo + numero da 1 a 16’
- scrivere il codice generato dalla prenotazione per ciascun tubino
Ai campioni del gruppo di 16 si applicano gli stessi requisiti già elencati sopra.
NB: E’ possibile cambiare il nome ad ogni singolo campione nella sezione “risultati”.
Si prega di segnalare eventuali pozzetti vuoti.
PIASTRE DA 96
- fornire piastre con pozzetti a V (piastre da PCR). Se non si possiedono piastre da 96 adatte, utilizzare 8 strisce di tubini da 12, possibilmente con tappi removibili, opportunamente identificati. Non verranno accettati tubini singoli.
- è possibile occupare tutti i 96 pozzetti.
Ai campioni della piastra si applicano gli stessi requisiti già elencati sopra.
NB: E’ possibile caricare un sample sheet per dare un nome personalizzato ad ogni singolo campione della piastra, nella sezione “modifica dati”.
Si prega di segnalare eventuali pozzetti vuoti.
- Filtro: dipende dai fluorocromi utilizzati
| D: | 6FAM | HEX | NED* | ROX | |
| E5: | R110 | R6G | TAMRA | ROX | LIZ |
| F: | 5FAM | JOE | NED* | ROX | |
| G5: | 6FAM | VIC* | NED* | PET* | LIZ |
| A4D_PP: | FL | JOE | TAMRA | CRX | |
| CC5_PP: | FL | JOE | TMR-ET | CXR-ET | CC5 |
| WEN_PP: | FL | JOE | TMR-ET | CXR-ET | WEN |
- *VIC, NED e PET: marcature consigliate, sono esclusive di Applied Biosystem
- NED e TAMRA in alcuni casi possono essere considerati intercambiabili, ma verificare sempre la compatibilità con filtro richiesto
- VIC, HEX e JOE in alcuni casi possono essere considerati intercambiabili, ma verificare sempre la compatibilità con filtro richiesto
- Nella tabella il marcatore compatibile è sottolineato in grassetto.
- Filtro A4D_PP e marcatore di peso molecolare ILS600 si usano per campioni preparati con kit Power Plex 16 System e Power Plex 16 HS di Promega.
- Marcatori di peso molecolare: dipendono da quali fluorocromi si sono usati e dalla lunghezza dei frammenti da analizzare. I marcatori disponibili presso il nostro laboratorio sono:
| Range * | N° picchi | Dimensioni | |
| Rox400 | 50-400 | 21 | 50, 60, 90, 100, 120, 150, 160, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400 |
| Rox500 | 35-500 | 16 | 35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250 (viene ignorato nell’analisi), 300, 340, 350, 400, 450, 490, 500 |
| Rox1000 | 100-539 | 17 | 29, 33, 37, 56, 64, 75, 81, 108, 118, 244, 275, 299, 421, 539, 674, 677, 928 (in condizioni denaturanti) |
| Rox1000BV | 50-1000 | 23 | 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 |
| Liz120 | 15-120 | 9 | 15, 25, 25, 35, 50, 62, 80, 110, 120 |
| Liz500 | 50-500 | 16 | 35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250 (viene ignorato nell’analisi), 300, 340, 350, 400, 450, 490, 500 |
| Liz600 | 20-600 | 36 | 20, 40, 60, 80, 100, 114, 120, 140, 160, 180, 200, 214, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 314, 320, 340, 360, 380, 400, 414, 420, 440, 460, 480, 500, 514, 520, 540, 560, 580, 600 |
- *Il Range rappresenta la finestra all’interno della quale vengono analizzati i frammenti. Prima e dopo il primo e l’ultimo picco eventuali frammenti vengono identificati ma l’errore di dimensionamento è molto alto
- Tutti i marcatori disponibili sono Applied Biosystems (Manuale di Genescan) tranne il ROX1000BV che è dalla ditta BioVentures.
- Per i marcatori inclusi nei kit commerciali (ad esempio Power Plex di Promega), per ciascun campione inviare una aliquota a parte contenente la quantità di marcatore 2X (se possibile), ovvero sufficiente per 2 caricamenti, come indicato nelle istruzioni del kit ed indicare nelle note i volumi per il caricamento
- Per altri marcatori, chiedere allo staff del servizio sequenziamento.
Alla pagina di PRENOTAZIONE selezionare il link “ELETTROFORESI DI GENESCAN E SNP”.
Formati prenotabili:
- CAMPIONI SINGOLI
- GRUPPO DI 16 CAMPIONi : la descrizione dei campioni sarà del tipo “nome del gruppo + numero da 1 a 16”. La descrizione dei singoli campioni può essere modificata nella sezione risultati
- PIASTRE DA 96 CAMPIONI : il nome di default dei campioni in piastra è NomePiastra-CoordinataPozzetto . I campioni possono essere nominati in modo personalizzato anche caricando il sample sheet nella sezione modifica dati
I risultati sono costituiti dal file del cromatogramma in formato .fsa.
Il file è visualizzabile con software proprietari a pagamento (Genemapper) o con il software gratuito Peakscanner.
Per piastre da 96 e gruppi da 16 campioni: 1-2 giorni dall’arrivo dei campioni in laboratorio.
Per campioni singoli: entro 3 giorni.
Per pochi campioni singoli urgenti è possibile prenotare il gruppo da 16 ed indicare l’urgenza sul foglio. Cercheremo di caricarli il prima possibile compatibilmente con il flusso di lavoro.
Inviare tubini, strip o piastre a temperatura ambiente secondo quanto indicato nelle indicazioni generali.
E’ possibile inviare il campione con il nostro corriere convenzionato, selezionando l’opzione specifica al momento della prenotazione.
Vedi dettagli alla pagina SPEDIZIONE.
Il campione viene ricaricato al massimo due volte. La seconda volta la quantità di marcatore aggiunta porta il suo volume totale a 50 % in più rispetto alle indicazioni del produttore. L’impossibilità di leggere il marcatore di peso molecolare è, a questo punto, indice della presenza di contaminanti nel campione.
