SEQUENZIAMENTO SANGER
IDENTIFICAZIONE BATTERICA (16S rRNA)

• Se possibile usare le strip di tubini
• Non mettere parafilm sui singoli tubini
• Non usare lo scotch per raggruppare i tubini
• Proteggere adeguatamente i tubini durante la spedizione
• Scrivere chiaramente il codice sui tubini, in particolare 5 e S, O e Ø (zero)
• Se si appongono etichette sui tubini, usare il minimo indispensabile di nastro adesivo
• Campioni risultanti non conformi ai requisiti possono subire dei ritardi o non venire processati; in ogni caso non verranno ripetuti in caso di problemi.

Per ogni batterio da tipizzare, inviare in tubini da 0,2 ml una colonia microlisata (5 min. a 100 °C) in 50 ul di un buffer qualsiasi 1X di PCR o in acqua, oppure 200 ng (conc. 10 ng/ul) di DNA genomico estratto.

All’atto della prenotazione, indicare il nome del campione, le sequenze che verranno generate successivamente (in numero variabile a seconda del tipo di servizio che si sceglie), verranno automaticamente nominate utilizzando come prefisso il nome del campione.

Siglare il tubo con il codice numerico cifre che viene generato al momento nella prenotazione.

All’arrivo del materiale in laboratorio viene inviata un’email di notifica di arrivo materiale.

Alla pagina “risultati” i campioni non saranno presenti fino a che non si otterrà l’amplificato del gene; solo allora i campioni compariranno nel sito web.

Il servizio Bact16S consiste di tre fasi:

• amplificazione del gene del 16S
• sequenziamento
• ricerca di omologia in database.

SERVIZIO STANDARD: viene effettuato un primo ciclo di amplificazione con 2 coppie di primer; in caso di fallimento viene fatto un secondo ciclo di PCR con altre 2 coppie di primer. In ogni ciclo è presente, oltre al controllo negativo, anche un controllo positivo su microlisato noto.

BACT16S-500 FAST: per accelerare i tempi vengono utilizzate contemporaneamente tutte le 4 coppie di primer a nostra disposizione; la PCR migliore purificata e sequenziata.

In ogni ciclo è presente, oltre al controllo negativo, anche un controllo positivo su microlisato noto.

Nel caso di Bact16S-500 il sequenziamento restituisce le prime 500 basi circa del gene (2 sequenze) che in genere sono sufficienti per l’identificazione a livello di specie.

Con Bact16S-1500 si ottengono 1500 basi circa (6 sequenze), cioè l’intero gene.

L’utente riceverà come risultati:

• le singole sequenze (file cromatogrammi) scaricabili alla pagina risultati
• report con i risultati della ricerca di omologia (blast) e con la sequenza consenso in formato testo (consenso)

Sarà eventualmente disponibile, su richiesta, la foto del gel con i risultati della PCR.

SERVIZIO STANDARD: il tempo minimo per l’analisi è di 3 giorni lavorativi dall’arrivo dei campioni. In genere, dalla produzione delle sequenze all’invio dei risultati finali è necessario un giorno.

Nel caso di problemi nell’amplificazione (la coppia standard di primer non funziona), o di sequenziamento, i tempi possono allungarsi.

BACT16S-500 FAST: salvo problemi gravi, i tempi di consegna dei risultati sono di 2-3 giorni a seconda dell’ora e giorno di arrivo secondo lo schema seguente:

• arrivo campioni entro le 12:00 (lun-giov): risultati entro 2 giorni lavorativi
• arrivo campioni dopo le 12:00 (lun-ven): risultati entro 3 giorni lavorativi

I campioni possono essere spediti a temperatura ambiente ma per evitare rischi di degradazione sarebbe preferibile che i campioni fossero spediti a 4 gradi.

E’ responsabilità dell’utente proteggere adeguatamente i campioni da eventuali schiacciamenti.

Le cause di fallimento possono essere diverse:

• la presenza nel microlisato di sostanze che inibiscono la reazione di PCR
• la presenza di batteri non appartenenti alla stessa colonia
• i primer universali non trovano un sito di attacco adeguato (primer specifici per la specie in oggetto ovviamente funzionerebbero)

I costi del servizio sono consultabili alla pagina listino prezzi.

Nei casi in cui non si proceda oltre la fase di amplificazione, verrà addebitato solo il costo delle attività svolte, pari a 20 Euro a campione, se era richiesta anche l’estrazione verranno addebitati 30 Euro a campione.

• Clarridge, J. E. III. (2004). Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin Microbiol Rev. 17, 840
• Xiang Y., Han W.: Bacterial identification based on 16S ribosomal RNA gene sequence analysis. W: Advanced Techniques in Diagnostic Microbiology, t.1, red.: Tang Y.W., Stratton C. W. Springer, Nashville, 2006; 323