Il primo livello prevede l’allineamento delle reads di ogni campione sul genoma di riferimento con conseguente valutazione della qualità degli allineamenti intesa come rapporto tra reads uniche e totale delle reads.
Nella fase di quantificazione tutti gli allineamenti che cadono all’interno degli esoni target predetti saranno conteggiati e associati ai rispettivi geni.
Per valutare la resa delle reads allineate nella fase di quantificazione, si produrranno delle statistiche sulla percentuale di allineamenti unici che cadono all’interno dei geni predetti e sulla classificazione degli stessi basata sull’annotazione genica (per sapere quanti allineamenti unici coprono geni codificanti, rRNA, miRNA etc …).
Il primo livello di analisi si conclude con la produzione di una matrice di conte grezze che esprime la quantificazione di ogni gene in tutti i campioni sequenziati.

Il secondo livello si focalizza sullo studio dell’espressione genica dei geni quantificati. Questa fase è anticipata da uno step di controllo dei campioni eseguito tramite l’ analisi delle componenti principali, che ha lo scopo di valutare quali campioni in replica sono eleggibili per l’analisi statistica.
Lo studio dell’espressione genica genererà una lista di geni differenzialmente espressi a cui saranno associati i parametri che esprimono il loro livello di significatività statistica.
Heatmaps e grafici valutativi della dispersione dei dati integreranno i risultati ottenuti.

Il terzo livello di analisi ha lo scopo di aiutare gli utenti ad interpretare i risultati ottenuti negli esperimenti di trascrittomica. I geni differenzialmente espressi saranno classificati sulla base dell’ontologia genica e successivamente raggruppati in liste da cui sarà possibile valutare i pathways di associazione, i domini proteici, i profili di trascrizione ed altre informazioni come ad esempio tutte le pubblicazioni che fanno riferimento al gene oggetto di studio.