Progetti NGS custom
Protocollo “a doppio step di PCR” parziale
- purifichiamo l’amplificato con
beads magneticheEsonucleasi Termolabile I (NEB)* - leghiamo gli
Index Illumina Nextera XTUnique Dual Indexes (UDI)** alle code universali in un secondo step di PCR; - normalizziamo i campioni;
- multiplexiamo fino a 188 campioni;
- carichiamo la libreria su Miseq** e la sequenziamo con strategia 300PE;
- controlliamo la qualità della corsa e consegniamo le reads in formato fastq.
Opzioni:
- analisi bioinformatica su richiesta;
- sviluppo di primer con code su richiesta e test delle condizioni di PCR.
Di seguito alcuni esempi di servizi che offriamo
Mini
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Progettazione
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Prelievo
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Estrazione
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Verifica del DNA
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Amplificazione
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Libreria e sequenziamento
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Analisi Tassonomica
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Analisi Avanzata
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Report interpretativo
Custom
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Progettazione
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Prelievo
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Estrazione
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Verifica del DNA
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Amplificazione
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Libreria e sequenziamento
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Analisi Tassonomica
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Analisi Avanzata
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Report interpretativo
Sviluppo
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Progettazione
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Prelievo
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Estrazione
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Verifica del DNA
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Amplificazione
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Libreria e sequenziamento
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Analisi Tassonomica
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Analisi Avanzata
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Report interpretativo
A partire dallo step centrale Libreria e sequenziamento puoi comporre il miglior protocollo che fa per te!
Requisiti per step
- CAMPIONI: il materiale in ingresso è rappresentato da ampliconi NON purificati in strip di tubini da 0,2 ml.
- IDENTIFICAZIONE: tutti i contenitori devono essere identificati con il codice assegnato da BMR in fase di prenotazione.
- CONSERVAZIONE: i campioni vanno tenuti tra +4°C e -80°C (ghiaccio secco), mantenere la catena del freddo ed evitare cicli di congelamento-scongelamento.
- QUANTITÀ e QUALITÀ: ogni amplicone fornito deve avere una concentrazione compresa tra 5 ng/ul e 20 ng/ul ed un volume minimo di 25ul.
- SPEDIZIONE: il materiale va inviato a seconda del metodo di conservazione, refrigerato a 4°C con siberini RIGIDI o a -80° con ghiaccio secco.
Nota I: è responsabilità dell’utente verificare che il campione contenga solo il DNA di interesse.
Nota II: gli ampliconi inviati devono essere muniti di idonee code per l’attacco degli adattatori Nextera XT Index kit – Illumina.
Nota III: gli ampliconi in ingresso non saranno verificati ma saranno avviati direttamente al sequenziamento e non è previsto il servizio di ricaricamento in caso di ottenimento di un numero inferiore di 50000 reads (+/- 20%) se i nostri controlli di processo hanno dato esito atteso.
- CAMPIONI: il materiale in ingresso è rappresentato da uno o due campioni di DNA in tubini da 0,2 mL.
- QUANTITÀ e QUALITÀ’: la concentrazione dev’essere compresa tra 3 e 10 ng/uL. Il volume dev’essere compreso tra 30 uL e 100 uL.
- SPEDIZIONE: il materiale va inviato a seconda del metodo di conservazione, refrigerato tra 4°C e -20°C con siberini RIGIDI o a -80° con ghiaccio secco.
- invio della sequenza 5′-3′ dei primer locus-specifici;
- paper di riferimento.
- Da discutere con l’area di bioinformatica (nextgen@bmr-genomics.it)
Risultati
Consegniamo alternativamente 3 differenti opzioni di output:
Fastq
Sequenze grezze prodotte dal sequenziatore e suddivise per campione (attese circa 50000 reads).
Analisi tassonomica (solo se concordata)
Fastq + analisi tassonomica basata su pipeline concordate.
Analisi Avanzata (solo se concordata)
Fastq + analisi tassonomica basata su pipeline concordate + analisi ecologiche e statistiche sulle ipotesi sperimentali del progetto.
Tempi di consegna
Le tempistiche possono variare in base alle code di lavoro e al servizio richiesto e sono di circa 4-8 settimane.
