Check del DNA genomico
Il DNA estratto da varie matrici è spesso difficile da quantificare a causa della presenza di contaminanti come composti organici che inducono a sovra o sottostimare la concentrazione degli acidi nucleici. Inoltre il DNA estratto da alcune matrici è complesso da amplificare per diverse ragioni: troppo bassa o troppo alta concentrazione, presenza di contaminanti o di DNA non target.
Risparmia tempo e denaro! Controlla il DNA prima di spedirlo.
Ti suggeriamo di testare l’amplificabilità dei tuoi campioni usando il nostro protocollo (con Platinum HiFi Taq – Thermofisher) oppure uno simile. Puoi usare un’altra taq (l’importante è che sia purificata da DNA batterico) o altri primer (ad es. senza coda, sempre tenendo presente che i primer senza coda sono più efficienti di quelli con la coda).
Pro341F: 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNBGCASCAG -3′
Pro805R: 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACNVGGGTATCTAATCC -3′
ITS3f: 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCATCGATGAAGAACGCAGC-3′
ITS4r: 5′-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTCCTCCGCTTATTGATATGC-3′
Protocollo di amplificazione con Taq Platinum HiFi (Termofisher)
| MIX | Volume (ul) |
|---|---|
| Buffer | 2,5 |
| MgSO4 (50 mM) | 1 |
| dNTPs mix (10 mM) | 0,5 |
| Primer forward (10 uM) | 1 |
| Primer reverse (10 uM) | 1 |
| Taq | 0,2 |
| Acqua DNA-free | 13,8 |
| Genomic DNA (3-10 ng/ul) | 5 |
Ciclo di amplificazione
| 1 ciclo | 25 cicli | 1 ciclo |
|---|---|---|
| 94°C per 1 min | 94°C per 30 sec; 55°C per 30 sec; 68°C per 45 sec | 68°C per 7 min |
Carica 5 μl della PCR su agarosio 1,5%: la minore concentrazione accettabile è 5 ng/μl.
Attenzione!!!
Se le condizioni di PCR usate sono diverse dalle nostre, i tuoi risultati possono non essere riproducibili nel nostro laboratorio.
Consigliamo di testare diverse diluizioni di DNA e di inviarci quella che ha dato i risultati migliori in amplificazione.
