Risultati

Le sequenze in formato FastQ vengono consegnate separate per ogni campione (attese almeno 50000 reads +/- 20%). Nota: in caso di output inferiori, i campioni saranno ricaricati solo se i nostri controlli di fase non avranno prodotto i risultati attesi.

Le sequenze grezze sono compresse in formato .gz e divise in R1 ed R2 (forward e reverse). Esempio:
ID12345_S53_L001_R1_001.fastq.gz
ID12345_S53_L001_R2_001.fastq.gz

Un esempio di una delle almeno 50000 sequenze prese dall’archivio ID12345_S53_L001_R1_001.fastq.gz e decompressa è riportato di seguito:

@M02007:29:000000000-AGKFV:1:1101:12161:1439 1:N:0:53
TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTGTGCAATGGGGGCAACCCTGCCACAGCGCCGCCGCGTGTG
TGACTCCTTCCCTCTGTTCTTTCACCTCTTTCATTCTTTCATCCACCCTCTTCCCCAACCCCTTTCTCTATT
TACCTTCCCTCCAGAGGACCCCCCCCCCCCCTCCGTCCCCGCCGCCCCTCTCATACTTCTTCTCCTTCCG
TTATTCTGTTTCTCTTCTCTTTCAGCGCTCCTTGGCGCCCCCTCCAGTCAGATCTTTCCGTCCTCGCCTCTC
CCCGGTCCTTTTCTCCTT
+
BCCC@F:C7FG+FFEGGFGFGDGGCEFEGCF,ED9FEGC,+8+,:CBE,,:,C,,C++8+6@+8+8+8,C,,,,,,,,9:49B,,,<<,<,,,:5,95,95,,,,,,,,,,,,,,,4++8,5<?=,+8++++,,78,7,88,,<,,9,8,33>6,,,+,++5+35***4**43<=*3*3;**1**/**12*0*+030**+*+*+*2+++0*02*).0+*++0+++0**+1**+)+)+((*.(.+*(()()((*(,(0(/*).))())))*0)7304,*,()((,0)()))(0*))).4)*/

Gestione del dato di sequenziamento: i dati vengono conservati nei nostri server per un periodo di 30 giorni dalla consegna. In caso di necessità di proroga possiamo formulare un’offerta di hosting su piattaforma cloud storage.

Metodo
Pipeline basata su Qiime2. Trimming dei primer usando Cutadapt, filtro di qualità, trimming delle estremità di minore qualità, denoising, dereplication, eliminazione delle chimere e rilevazione delle ASV con DADA2. Allineamento contro Greengenes 2 e assegnazione tassonomica.

Risultati: una cartella compressa tramite link al cloud Mega. Il file più importante nella cartella è un file index.html che si collega a una pagina Web interattiva con sunburst, grafici a torta per campione e collegamenti per la tabella della tassonomia e download delle sequenze fastq. Un esempio dell’output è disponibile a questo link.

Questa pipeline fornisce le analisi ecologiche di alfa e beta-diversity, costruendo grafici di rarefazione, matrici di distanza, alberi filogenetici, grafici 3D PCoA, heatmap e box-plot e fornendo analisi statistiche del confronto di gruppi sperimentali. Un esempio dell’output è disponibile qui.
L’analisi non comprende l’interpretazione organica e l’integrazione dei dati (simile ad un paper). Tale elaborazione viene effettuata solo su richiesta.

Metodo
La pipeline avanzata prevede le stesse fasi di pre-elaborazione e identificazione delle ASV dell’analisi tassonomica basata su Qiime2. L’assegnazione tassonomica viene effettuata sia sul database Silva138 che su Greengenes2. L’analisi di rarefazione permette di comprendere a che numero di sequenze normalizzare i risultati ed eventualmente consente di eliminare qualche campione poco informativo.
Le analisi di alpha-diversity vengono effettuate utilizzando diversi indici (es. Shannon, Simpson, Faith_PD, etc) e il test di Kruskal-Wallis viene applicato per verificare la significatività della differenza di tali indici tra i gruppi sperimentali.
Le analisi di beta-diversity vengono effettuate utilizzando diverse metriche (es. Unifrac pesata e non pesata, Jaccard, Bray-curtis, etc) e vengono trasformate in grafici PCoA 3D; inoltre il test di statistica multivariata PERMANOVA viene applicato per verificare la significatività della differenza tra i gruppi sperimentali.
Il test ANCOM viene utilizzato per analizzare l’abbondanza differenziale tra gruppi sperimentali, sia a livello di ASV che per taxon (Phylum, Genere..). Ove possibile viene effettuata anche un’analisi longitudinale.

Risultati
Un PDF con la descrizione delle metodiche utilizzate e un link al cloud Mega. Questo porta ad una cartella compressa il cui file più importante index.html che si collega a una pagina Web interattiva con una tabella in cui ad ogni analisi corrisponde una spiegazione e il link all’elaborato. Le sequenze sono solitamente disposte in una cartella differente. Un esempio dell’output è disponibile su richiesta.

La consegna dei risultati è solitamente corredata da una call di spiegazione.

Quando usare questa analisi
Per ogni progetto in cui sia necessario un confronto tra ipotesi sperimentali (gruppi di campioni) che comprendano almeno 5 repliche biologiche l’uno. Gruppi più piccoli sono sconsigliati per probabile scarsa informatività dell’analisi.

Esempio di Mapping file da compilare, composto da due ipotesi sperimentali (Controllo e Dieta):

Sample-ID    Treatment
Campione1    Controllo
Campione2    Controllo
Campione3    Controllo
Campione4    Dieta
Campione5    Dieta
Campione6    Controllo
Campione7    Controllo
Campione8    Dieta
Campione9    Dieta
Campione10    Dieta

Simile all’Analisi Tassonomica 16S-NGS ma con il database di confronto diverso: UNITE per ITS, PR2 per 18S e BOLD per COI.

Come l’Analisi Avanzata 16S-NGS ma con il database di confronto diverso (UNITE) e senza metriche filogenetiche in quanto l’ITS non è un marker filogenetico.

Su richiesta possiamo sviluppare delle pipeline tassonomiche o avanzate per target genici diversi o con database differenti. Contattaci su nextgen@bmr-genomics.it.