PNAs
L’analisi metabarcoding delle comunità batteriche (target V3-V4 o V4 del 16S rRNA) presenti in campioni
contaminati da cellule vegetali è spesso complicata, infatti l’amplificazione del 16S di cloroplasti e
mitocondri generalmente prende il sopravvento e, in ultima analisi, mediamente più dell’80% delle
sequenze ottenute corrisponde ai geni contaminanti.
Utilizzando i PNA (Peptide Nucleic Acids) è possibile inibire l’amplificazione dei contaminanti,
permettendo l’amplificazione selettiva del 16S batterico e la conseguente identificazione pressoché
completa delle comunità procariotiche. Tuttavia l’efficacia dell’inibizione dipende da diversi fattori, come il rapporto 16S plastidiale/16S batterico e la presenza di mismatch tra il PNA e la sequenza target.
Sequenza delle PNA (Lundberg et al., 2013)
pPNA: 5’-GGCTCAACCCTGGACAG-3’
mPNA: 5’-GGCAAGTGTTCTTCGGA-3’
Specificità
I PNA disponibili sono specifici per la regione V4 del 16S rRNA di cloroplasti e mitocondri e vengono utilizzati in fase di amplificazione ad una concentrazione di 0,5 uM per campione, adeguata per garantire un’efficiente inibizione dell’amplificazione di contaminanti. In questo modo si può osservare un incremento del numero di specie batteriche identificate e della loro abbondanza relativa, se confrontato con l’amplificazione degli stessi campioni in assenza di PNA.
Specie inibite dal pPNA:
Aquilegia coerulea, Arabidopsis thaliana, Brachypodium distachyon, Brassica rapa, Carica papaya, Citrus sinensis, Cucumis sativus, Eucalyptus grandis, Fragaria vesca, Glycine max, Gossypium raimondii, Hordeum vulgare, Linum usitatissimum, Manihot esculenta, Medicago truncatula, Oryza sativa, Panicum virgatum, Phaseolus vulgaris, Physcomitrella patens, Populus trichocarpa, Prunus persica, Ricinus communis, Ricinus communus, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor, Theobroma cacao, Vitis vinifera, Zea mays.
Specie inibite dal mPNA:
Arabidopsis thaliana, Brassica rapa, Carica papaya, Cucumis sativus, Glycine max, Malus domestica, Medicago truncatula, Mimulus guttatus, Oryza sativa, Ricinus communis, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor, Vitis vinifera, Zea mays.
IMPORTANTE: il 16S plastidiale appartenente alle piante della famiglia Asteraceae presenta mismatch
con il pPNA, riducendo notevolmente la sua efficienza di inibizione.
Di default utilizziamo entrambe le PNA, qualora avessi delle richieste diverse contattaci.
